Ученые достигли предела разрешения микроскопии

Ученые смогли сфотографировать атом водорода, запечатлев электронные облака. И хотя современные физики с помощью ускорителей могут определять даже форму протона, атом водорода, по-видимому, так и останется самым мелким объектом, изображение которого имеет смысл называть фотографией. «Лента.ру» представляет обзор современных методов фотографирования микромира.

Строго говоря, обычной фотографии в наши дни почти не осталось. Изображения, которые мы по привычке называем фотографиями и можем найти, к примеру, в любом фоторепортаже «Ленты.ру», вообще-то, являются компьютерными моделями. Светочувствительная матрица в специальном приборе (по традиции его продолжают называть «фотоаппаратом») определяет пространственное распределение интенсивности света в нескольких разных спектральных диапазонах, управляющая электроника сохраняет эти данные в цифровом виде, а потом другая электронная схема на основе этих данных отдает команду транзисторам в жидкокристаллическом дисплее. Пленка, бумага, специальные растворы для их обработки — все это стало экзотикой. А если мы вспомним буквальное значение слова, то фотография — это «светопись». Так что говорить о том, что ученым удалось сфотографировать атом, можно лишь с изрядной долей условности.

Больше половины всех астрономических снимков уже давно делают инфракрасные, ультрафиолетовые и рентгеновские телескопы. Электронные микроскопы облучают не светом, а пучком электронов, а атомно-силовые и вовсе сканируют рельеф образца иглой. Есть рентгеновские микроскопы и магнитно-резонансные томографы. Все эти приборы выдают нам точные изображения различных объектов, и несмотря на то что о «светописи» говорить здесь, разумеется, не приходится, мы все же позволим себе именовать такие изображения фотографиями.

Эксперименты физиков по определению формы протона или распределения кварков внутри частиц останутся за кадром; наш рассказ будет ограничен масштабами атомов.
Оптика не стареет

Как выяснилось во второй половине XX века, оптическим микроскопам еще есть куда развиваться. Решающим моментом в биологических и медицинских исследованиях стало появление флуоресцентных красителей и методов, позволяющих избирательно помечать определенные вещества. Это не было «всего лишь новой краской», это был настоящий переворот.

Вопреки расхожему заблуждению, флуоресценция — это вовсе не свечение в темноте (последнее называется люминесценцией). Это явление поглощения квантов определенной энергии (скажем, синего света) с последующим излучением других квантов меньшей энергии и, соответственно, иного света (при поглощении синего испускаться будут зеленые). Если поставить светофильтр, который пропускает только излучаемые красителем кванты и задерживает свет, вызывающий флуоресценцию, можно увидеть темный фон с яркими пятнами красителей, а красители, в свою очередь, могут расцвечивать образец чрезвычайно избирательно.

Например, можно покрасить цитоскелет нервной клетки красным, синапсы выделить зеленым, а ядро — голубым. Можно сделать флуоресцентную метку, которая позволит обнаружить белковые рецепторы на мембране или синтезируемые клеткой в определенных условиях молекулы. Метод иммуногистохимического окрашивания совершил революцию в биологической науке. А когда генные инженеры научились делать трансгенных животных с флуоресцентными белками, этот метод пережил второе рождение: реальностью стали, например, мыши с окрашенными в разные цвета нейронами.

Для получения этого снимка (завоевавшего первое место на конкурсе Nikon Small World в 2000 году) использовалось сочетание флуоресцентной микроскопии со специальной методикой повышения контрастности прозрачных структур, основанной на разности скорости света в различных материалах.
1/5

Кроме того, инженеры придумали (и отработали на практике) метод так называемой конфокальной микроскопии. Суть его заключается в том, что микроскоп фокусируется на очень тонкий слой, а специальная диафрагма отсекает создаваемую объектами вне этого слоя засветку. Такой микроскоп может последовательно сканировать образец сверху вниз и получать стопку снимков, которая является готовой основой для трехмерной модели.

Использование лазеров и сложных оптических систем управления лучом позволило решить проблему выгорания красителей и высыхания нежных биологических образцов под ярким светом: луч лазера сканирует образец только тогда, когда это необходимо для съемки. А чтобы не тратить время и силы на осмотр большого препарата через окуляр с узким полем зрения, инженеры предложили автоматическую систему сканирования: на предметный столик современного микроскопа можно положить стекло с образцом, и прибор самостоятельно отснимет масштабную панораму всего образца. При этом в нужных местах он будет наводить на резкость, а затем склеит множество кадров воедино.

В некоторые микроскопы можно посадить живых мышей, крыс или хотя бы мелких беспозвоночных животных. Другие дают небольшое увеличение, зато совмещены с рентгеновским аппаратом. Многие для устранения помех от вибраций монтируются на специальных столах массой в несколько тонн внутри помещений с тщательно контролируемым микроклиматом. Стоимость подобных систем превышает стоимость иных электронных микроскопов, а конкурсы на самый красивый кадр давно стали традицией. Кроме того, продолжается и совершенствование оптики: от поиска лучших сортов стекла и подбора оптимальных комбинаций линз инженеры перешли к принципиально новым способам фокусировки света.

Мы специально перечислили ряд технических подробностей для того, чтобы показать: прогресс в области биологических исследований давно связан с прогрессом в других областях. Если бы не существовало компьютеров, способных автоматически сосчитать число окрашенных клеток на нескольких сотнях фотографий, толку от супермикроскопов было бы немного. А без флуоресцентных красителей все миллионы клеток были бы неотличимы друг от друга, так что проследить за формированием новых или гибелью старых было бы практически невозможно.

По сути, первый микроскоп представлял собой струбцину с закрепленной на ней сферической линзой. Аналогом такого микроскопа может быть простая игральная карта с проделанным в ней отверстием и каплей воды. По некоторым данным подобные устройства применяли золотодобытчики на Колыме уже в прошлом столетии.
1/3
За дифракционным пределом

У оптических микроскопов есть принципиальный недостаток. Дело в том, что по форме световых волн невозможно восстановить форму тех предметов, которые оказались намного меньше длины волны: с тем же успехом можно пытаться исследовать тонкую текстуру материала рукой в толстой перчатке для сварочных работ.

Ограничения, создаваемые дифракцией, отчасти удалось преодолеть, причем без нарушения законов физики. Поднырнуть под дифракционный барьер оптическим микроскопам помогают два обстоятельства: то, что при флуоресценции кванты излучаются отдельными молекулами красителя (которые могут довольно далеко отстоять друг от друга), и то, что за счет наложения световых волн можно получить яркое пятно с диаметром, меньшим, чем длина волны.

При наложении друг на друга световые волны способны взаимно друг друга погасить, поэтому можно подобрать параметры освещения образца так, чтобы в яркую область попадал по возможности меньший участок. В сочетании с математическими алгоритмами, которые позволяют, например, убрать двоение изображения, такое направленное освещение дает резкое повышение качества съемки. Становится возможным, к примеру, исследовать в оптический микроскоп внутриклеточные структуры и даже (комбинируя описанный метод с конфокальной микроскопией) получать их трехмерные изображения.
Электронный микроскоп до электронных приборов

Для того чтобы открыть атомы и молекулы, ученым не пришлось их рассматривать — молекулярная теория не нуждалась в том, чтобы видеть объект. А вот микробиология стала возможна только после изобретения микроскопа. Поэтому первое время микроскопы ассоциировались именно с медициной и биологией: физики и химики, изучавшие существенно меньшие объекты, обходились другими средствами. Когда же и им захотелось посмотреть на микромир, дифракционные ограничения стали серьезной проблемой, тем более что описанные выше методы флуоресцентной микроскопии были еще неизвестны. Да и толку от повышения разрешающей способности с 500 до 100 нанометров немного, если объект, который надо рассмотреть, еще меньше!

Зная о том, что электроны могут себя вести и как волна, и как частица, физики из Германии в 1926 году создали электронную линзу. Идея, лежащая в ее основе, была очень простой и понятной любому школьнику: раз электромагнитное поле отклоняет электроны, то с его помощью можно поменять форму пучка этих частиц, растащив их в разные стороны, или, напротив, уменьшить диаметр пучка. Спустя пять лет, в 1931 году Эрнст Руска и Макс Кнолл построили первый в мире электронный микроскоп. В приборе образец сначала просвечивался пучком электронов, а потом электронная линза расширяла прошедший насквозь пучок перед тем, как тот падал на специальный люминесцентный экран. Первый микроскоп давал увеличение всего в 400 раз, но замена света на электроны открыла дорогу к фотографированию с увеличением в сотни тысяч раз: конструкторам пришлось всего лишь преодолеть несколько препятствий технического характера.По сути, первый микроскоп представлял собой струбцину с закрепленной на ней сферической линзой. Аналогом такого микроскопа может быть простая игральная карта с проделанным в ней отверстием и каплей воды. По некоторым данным подобные устройства применяли золотодобытчики на Колыме уже в прошлом столетии.
1/3
За дифракционным пределом

У оптических микроскопов есть принципиальный недостаток. Дело в том, что по форме световых волн невозможно восстановить форму тех предметов, которые оказались намного меньше длины волны: с тем же успехом можно пытаться исследовать тонкую текстуру материала рукой в толстой перчатке для сварочных работ.

Ограничения, создаваемые дифракцией, отчасти удалось преодолеть, причем без нарушения законов физики. Поднырнуть под дифракционный барьер оптическим микроскопам помогают два обстоятельства: то, что при флуоресценции кванты излучаются отдельными молекулами красителя (которые могут довольно далеко отстоять друг от друга), и то, что за счет наложения световых волн можно получить яркое пятно с диаметром, меньшим, чем длина волны.

При наложении друг на друга световые волны способны взаимно друг друга погасить, поэтому можно подобрать параметры освещения образца так, чтобы в яркую область попадал по возможности меньший участок. В сочетании с математическими алгоритмами, которые позволяют, например, убрать двоение изображения, такое направленное освещение дает резкое повышение качества съемки. Становится возможным, к примеру, исследовать в оптический микроскоп внутриклеточные структуры и даже (комбинируя описанный метод с конфокальной микроскопией) получать их трехмерные изображения.
Электронный микроскоп до электронных приборов

Для того чтобы открыть атомы и молекулы, ученым не пришлось их рассматривать — молекулярная теория не нуждалась в том, чтобы видеть объект. А вот микробиология стала возможна только после изобретения микроскопа. Поэтому первое время микроскопы ассоциировались именно с медициной и биологией: физики и химики, изучавшие существенно меньшие объекты, обходились другими средствами. Когда же и им захотелось посмотреть на микромир, дифракционные ограничения стали серьезной проблемой, тем более что описанные выше методы флуоресцентной микроскопии были еще неизвестны. Да и толку от повышения разрешающей способности с 500 до 100 нанометров немного, если объект, который надо рассмотреть, еще меньше!

Зная о том, что электроны могут себя вести и как волна, и как частица, физики из Германии в 1926 году создали электронную линзу. Идея, лежащая в ее основе, была очень простой и понятной любому школьнику: раз электромагнитное поле отклоняет электроны, то с его помощью можно поменять форму пучка этих частиц, растащив их в разные стороны, или, напротив, уменьшить диаметр пучка. Спустя пять лет, в 1931 году Эрнст Руска и Макс Кнолл построили первый в мире электронный микроскоп. В приборе образец сначала просвечивался пучком электронов, а потом электронная линза расширяла прошедший насквозь пучок перед тем, как тот падал на специальный люминесцентный экран. Первый микроскоп давал увеличение всего в 400 раз, но замена света на электроны открыла дорогу к фотографированию с увеличением в сотни тысяч раз: конструкторам пришлось всего лишь преодолеть несколько препятствий технического характера.

Электронный микроскоп позволил рассмотреть устройство клеток в недосягаемом ранее качестве. Но по этому снимку нельзя понять возраст клеток и наличие в них тех или иных белков, а эта информация очень нужна ученым.
1/3

Сейчас электронные микроскопы позволяют фотографировать вирусы крупным планом. Существуют разные модификации приборов, позволяющие не только просвечивать тонкие срезы, но и рассматривать их в «отраженном свете» (в отраженных электронах, конечно). Мы не будем подробно рассказывать про все варианты микроскопов, но заметим, что недавно исследователи смогли создать электронный микроскоп без линз — они научились восстанавливать изображение по дифракционной картине.
Потрогать, а не рассмотреть

Еще одна революция произошла за счет дальнейшего отхода от принципа «осветить и посмотреть». Атомный силовой микроскоп, равно как и сканирующий туннельный микроскоп, уже ничем на поверхность образцов не светит. Вместо этого по поверхности перемещается особо тонкая игла, которая буквально подпрыгивает даже на неровностях размером с отдельный атом.

Не вдаваясь в детали всех подобных методов, заметим главное: иглу туннельного микроскопа можно не только перемещать вдоль поверхности, но и использовать для перестановки атомов с места на место. Именно таким образом ученые создают надписи, рисунки и даже мультфильмы, в которых нарисованный мальчик играет с атомом. Настоящим атомом ксенона, перетаскиваемым иглой сканирующего туннельного микроскопа.

Туннельным микроскоп называют потому, что он использует эффект протекающего через иглу туннельного тока: электроны проходят через зазор между иглой и поверхностью за счет предсказанного квантовой механикой туннельного эффекта. Для работы такого прибора нужен вакуум.

Намного менее требователен к окружающим условиям атомный силовой микроскоп (АСМ) — он может (с рядом ограничений) работать без откачки воздуха. В определенном смысле АСМ является нанотехнологичным наследником патефона. Игла, закрепленная на тонком и гибком кронштейне-кантилевере (cantilever и есть «кронштейн»), движется вдоль поверхности без подачи на нее напряжения и следует рельефу образца так же, как игла патефона следует вдоль бороздок грампластинки. Изгиб кантилевера заставляет отклоняться закрепленное на нем зеркало, зеркало отклоняет лазерный луч, и это позволяет очень точно определять форму исследуемого образца. Главное только иметь достаточно точную систему перемещения иглы, а также запас игл, которые должны быть идеально острыми. Радиус закругления у кончиков таких игл может не превышать одного нанометра.

АСМ позволяет видеть отдельные атомы и молекулы, однако, как и туннельный микроскоп, не позволяет заглянуть под поверхность образца. Иными словами, ученым приходится выбирать между возможностью видеть атомы и возможностью изучать весь объект целиком. Впрочем, и для оптических микроскопов внутренности изучаемых образцов не всегда доступны, ведь минералы или металлы обычно свет пропускают плохо. Кроме того, с фотографированием атомов все равно возникают сложности — эти объекты предстают простыми шариками, форма электронных облаков на таких снимках не видна.

Детектор CMS Большого Адронного Коллайдера
Фото: CERN
Несмотря на то что ускорители заряженных частиц позволили открыть кварки и выяснить структуру составных частиц, их ни в коем случае нельзя отнести к микроскопам.
На просвет

Если заменить свет на рентгеновское излучение, можно просветить и непрозрачные предметы. Настоящий прорыв в этой области произошел тогда, когда физики разработали способ получения ярких пучков рентгеновских лучей и научились управлять ими, создав рентгеновскую оптику.

Синхротронное излучение, возникающее при торможении разогнанных ускорителями заряженных частиц, позволяет изучать окаменевшие останки доисторических животных. Вращая образец под рентгеновскими лучами, мы можем получать трехмерные томограммы — именно так был найден, например, мозг внутри черепа рыб, вымерших 300 миллионов лет назад. Можно обойтись и без вращения, если дополнить регистрацию прошедшего излучения фиксацией рассеянных за счет дифракции рентгеновских лучей.

И это еще не все возможности, которые открывает рентгеновское излучение. При облучении им многие материалы флуоресцируют, причем по характеру флуоресценции можно определить химический состав вещества: таким способом ученые определяют окраску древних артефактов, цвета потускневших рисунков, читают стертые в Средние века труды Архимеда или узнают окраску перьев давно вымерших птиц.
Позируют атомы

На фоне всех тех возможностей, которые предоставляют рентгеновские или оптико-флуоресцентные методы, новый способ фотографирования отдельных атомов уже кажется не таким уж большим прорывом в науке. Суть метода, который позволил получить представленные на этой неделе изображения, такова: с ионизированных атомов срывают электроны и направляют их на специальный детектор. Каждый акт ионизации срывает электрон с определенного положения и дает одну точку на «фотографии». Накопив несколько тысяч таких точек, ученые сформировали картинку, отображающую наиболее вероятные места обнаружения электрона вокруг ядра атома, а это по определению и есть электронное облако.

В заключение скажем, что возможность видеть отдельные атомы с их электронными облаками — это скорее вишенка на торте современной микроскопии. Ученым было важно исследовать структуру материалов, изучать клетки и кристаллы, а обусловленное этим развитие технологий дало возможность дойти до атома водорода. Все, что меньше, — уже сфера интересов специалистов по физике элементарных частиц. А биологам, материаловедам и геологам еще есть куда совершенствовать микроскопы даже с довольно скромным на фоне атомов увеличением. Специалистам по нейрофизиологии, к примеру, давно хочется иметь прибор, способный видеть отдельные клетки внутри живого мозга, а создатели марсоходов продали бы душу за электронный микроскоп, который влезал бы на борт космического аппарата и мог бы работать на Марсе.

Алексей Тимошенко

Источник http://lenta.ru/articles/2013/06/02/micro/